全球非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）作为全球高发的肝脏疾病，其肝脏纤维化检测刚需也在持续增长。肝纤维化（HF）是一种临床上较为常见的肝脏受损后的病理性修复反应，是慢性肝病转向肝硬化的核心环节。
肝纤维化的发病机制
HF发病的分子机制复杂，肝脏受损引起多种细胞释放一系列细胞因子，进而启动下游通路进行信号转导，活化肝星状细胞（HSCs）并使其向肌成纤维细胞（MFBs）转化。MFBs可释放大量细胞外基质（ECM），进而破坏肝脏正常结构，导致HF的发生发展。HF相关治疗靶点仍处于动物实验阶段，尚未应用于临床[1]。
细胞因子诱导机制
TGF-β：可以调节细胞生长、分化、ECM重构、内皮间质转化等。在哺乳动物中TGF-β家族包括3种不同的亚型（TGF-β1， TGF-β2和TGF-β3），它们的序列和结构具有较高的相似性（70-82%），在体内也具有相似的生物功能，其中TGF-β1在各种组织中的表达水平、生物活性较好，对纤维化疾病的发展有较大影响[2]。
TGF-β信号通路是促进HSC活化和诱导ECM生成的关键信号通路。当肝脏受到损伤因子刺激时，TGF-β通过结合TGFβⅡ型受体(TβRⅡ)开始信号传导，募集TGF-βⅠ型受体(TβRⅠ)，随后后者发生构象改变，使下游SMAD2和SMAD3蛋白持续磷酸化为pSMAD2和pSMAD3后与SMAD4形成复合物易位到细胞核结合DNA，调节多个靶基因如αSMA、CTGF的转录，最终使HSC活化，并诱导Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成，而SMAD7则抑制该通路[3]。
图 1 肝纤维化信号传导通路图
肝脏纤维化模型构建流程[4]
LX－2 细胞作为应用最广泛的 HSCs 体外细胞模型之一，因保留着活化HSCs 的关键特征，如细胞因子信号传导、神经元基因表达、维甲酸代谢和纤维形成等，已广泛应用于肝炎及纤维化的体外研究，同时在成纤维细胞样表型转化研究中也发挥重要作用
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LX－2 细胞在含 10% FBS、1% 青-链霉素溶液的高糖DMEM 完全培养基中进行常规培养，隔日换液，待细胞生长至 80% ～90%密度时，传代；
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用胰酶消化处理，收集细胞，以合适密度接种于孔板中培养；
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实验前用1%血清DMEM饥饿处理24h；
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将细胞分为2组：正常组不做处理，模型组采用10ng/mL TGF-β1(Cat. No.:CA59)诱导LX-2肝星状细胞活化，培养24h后收集细胞进行模型评估。
注意事项：TGF-β1诱导细胞纤维化过程中，血清饥饿处理、细胞密度、因子浓度和作用时间均影响模型的成功建立。在实验初始阶段建议尝试不同的细胞密度，诱导浓度和时间以达到最佳效果。文献中一般采用5–10 ng/mL的TGF-β1进行处理24–48小时，具体可根据细胞响应程度适当调整浓度和处理时间。
纤维化模型评价
纤维化模型常用的评价方法包括检测纤维蛋白的合成和沉积情况、观察细胞形态的改变以及测定相关蛋白和基因的表达水平等。通过这些评估方法，可以全面地了解细胞纤维化的发生过程和机制，以下为相关鉴定指标：
形态学变化
LX-2细胞经TGFβ1处理后，形态从多角形或短梭形向纺锤形或梭形变化[5]。
图2 细胞形态变化[6]
功能学验证
通过 Transwell 法检测 LX-2 细胞在 TGF-β1 刺激下的纵向迁移能力，EdU检测模型组增殖能力显著提升。
图3 Transwell 和Edu分别评估LX-2肝星状细胞的迁移和增殖能力[7]
蛋白/基因水平
采用IF、WB或PCR方法检测α-SMA和CollagenⅠ在 LX-2细胞中的表达情况，模型组中两种蛋白的表达均升高；WB检测TGF-β1/Smad通路中相关蛋白（Smad2，Smad3，Smad7）的表达，TGF- β1 显著上调了Smad2和Smad3的磷酸化，并且抑制了Smad7 的表达。
图4 TGF-β1诱导的LX-2细胞标志蛋白(α-SMA和Collagen I)激活[6]
图5 TGF-β1诱导的LX-2细胞信号通路中相关蛋白（Smad2，Smad3，Smad7）的表达[7]
近岸蛋白提供低内毒素，高纯度，高活性，高批间一致性的重组TGF-β1蛋白，该产品荣获CiteAb引用前100，适用于多种类型细胞培养。此外，公司现有TGF-β相关产品二十余种，也可满足靶向TGF-β药物研发、功能评估和质量控制等不同环节的需求。
科研级：Recombinant Human TGF-beta 1(Cat. No.:CA59)
Measured by its ability to inhibit the IL-4-dependent proliferation of TF1 human erythroleukemic cells. The ED50 for this effect is 4-40 pg/ml.
GMP级：Recombinant Human TGF-beta 1(Cat. No.:GMP-CA59)
Measured by its ability to inhibit the IL-4-dependent proliferation of TF1 human erythroleukemic cells. The specific activity of recombinant human TGF-beta 1 is ≥2.0 x 107 IU/mg, which is calibrated against the human TGF beta 1 Standard (NIBSC code: 89/514) .
TGF-β蛋白相关产品
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参考文献
[1]廖昭辉,谢正元. 肝纤维化发病的分子机制及其相关治疗靶点的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2024, 50(5): 1450-1456.
[2]Chung J Y, Chan MK, Li JS, et al. TGF-β Signaling: From Tissue Fibrosis to Tumor Microenvironment [J]. Int J Mol Sci, 2021, 22: undefined. doi:10.3390/ijms22147575
[3]鲁苏日古嘎, 刘霆, 朱单单, 等. 肝纤维化相关信号通路及其相应的抗肝纤维化药物研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2022, 38(5): 1161-1164. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.05.039.
[4] Kang H, Seo E, Oh YS, Jun HS. TGF-β activates NLRP3 inflammasome by an autocrine production of TGF-β in LX-2 human hepatic stellate cells. Mol Cell Biochem. 2022;477(5):1329-1338. doi:10.1007/s11010-022-04369-5
[5]王冰莹,杜鸿.TGF-β1体外诱导肝星形细胞活化中自噬和mTOR通路的变化[J].江苏大学学报(医学版),2016,26(02):154-158.DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.y160002.
[6] Xu S, Chen Y, Miao J, Li Y, Liu J, Zhang J, Liang J, Chen S, Hou S. Esculin inhibits hepatic stellate cell activation and CCl4-induced liver fibrosis by activating the Nrf2/GPX4 signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Jun; 128:155465. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155465. Epub 2024 Feb 17. PMID: 38471319
[7]宋安宁,张甜甜,郑珊珊,等.香紫苏醇通过调控TGF-β/Smad信号通路抑制肝星状细胞活化及肝纤维化[J].世界科学技术-中医药现代化,2024,26(12):3136-3144.